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Hinweise zur Probenabgabe

Probenkonzentration:

Die Konzentration eines jeden Proteins sollte bei ca. 50 µM liegen. Abweichungen sind in Ausnahmefällen möglich, wenn z.B. 2:1 Komplexe untersucht werden sollen. Sollten die Proteine in diesen Konzentrationen nicht stabil sein, so kann ggf. bis zu 10-fach verdünnt gemessen werden. Dies ist allerdings nicht zu empfehlen, da dann wahrscheinlich nicht mehr alle Peptide hinreichend intensive Signale für eine Auswertung ergeben. In jedem Fall wird der manuelle Annotierungsaufwand deutlich höher, weil DynamiX bei weniger intensiven Signalen erfahrungsgemäß deutlich mehr Falsch- und/oder Fehlzuordnungen trifft.

Volumen:

In IARS wird am Ende der Auftragserfassung angezeigt welches Volumen für jeden zu messenden State erforderlich ist. Bitte dieses Volumen keinesfalls unterschreiten. Das minimale notwendige Volumen ist abhängig von der Anzahl der zu messenden Zeitpunkte eines jeden States. Für jede Injektion werden ca. 8 µL verbraucht. Typischerweise messen wir jeden Zeitpunkt 3-fach, t0 sogar 4-fach. Hinzu kommt eine Injektion zum Einlaufen des Systems sowie ca. 20-25 µL "Totvolumen", welches in den Vials verbleibt.

Vials:

Für jeden "State" muss ein separates Vial befüllt werden. Zu verwenden sind spezielle konisch zulaufende Glas-Vials, die vom Gerätezentrum zur Verfügung gestellt werden.

H₂O-Puffer:

Der H₂O-Puffer ist in der Regel fertig angesetzt mit den Proben zusammen kundenseitig bereit zu stellen. Benötigt werden min. 5 mL, besser 10 mL.   

D₂O-Puffer:

Für den D₂O-Puffer sind die Chemikalien entweder vorgewogen für 5 bzw. max. 10 mL in einem Falcon-Tube kundenseitig bereit zu stellen oder aber die Pufferherstellung wird von den Mitabreiterinnen und Mitarbeitern des Gerätezentrums übernommen. Gängige Standard-Pufferkomponenten sind vorrätig. Uni-interne Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter können in Labor D059 mit dem dort vorrätigen D₂O den Puffer auch selber herstellen. Magnetrührer, pH-Meter sowie NaOD und DCl zum Einstellen des pH-Wertes sind vorhanden. 

In Ausnahmefällen (Zusatz von Substrat, Inhibitor, etc.) kann es notwendig sein bestimmte Zusätze in den Puffern zu lösen - und zwar immer dann, wenn die Löslichkeit von den zugesätzten Substanzen in der Protein-Stock-Solution bei ca. 10-facher Überdosierung (die Probe wird zur Inkubation in H₂O- bzw. D₂O-Puffer ca. 10-fach in diesen verdünnt) nicht mehr ausreichend ist. Sollen nur einzelne States mit diesen Zusätzen gemessen werden, so muss das Experiment messtechnisch unterteilt werden, da es im Autosampler jeweils nur eine Position für die Puffer gibt. Ein automatischer Austausch von Pufferlösungen ist nicht möglich.  

Löslichkeit im Quench-Puffer und ggf. Anpassen der Quench-Bedingungen:

Die Rücktauschreaktion, die während der folgenden Chromatographie abläuft, besitzt ein Geschwindigkeitsminimum etwa bei pH 2.3-2.5. Verwendet wird deshalb typischerweise ein 400 mM Quenchpuffer auf Phosphatbasis (KH₂PO₄ und Phosphorsäure) mit pH 2.4. Unter diesen Bedingungen sind einige Proteine nicht stabil. Deshalb macht es Sinn die Stabilität unter Quenchbedingungen VOR DER MESSUNG zu überprüfen.  
Sollte das Protein in einer Konzentration von ca. 5µm beim Mischen 1:1 mit Quenchpuffer innerhalb der ersten 10-20 Sekunden ausfallen, so gibt es verschiedene Möglichkeiten der Stabilisierung. Es kann z.B. Guanidinium-HCl zu dem Quenchpuffer gegeben werden. Allerdings sollte die Endkonzentration nach dem 1:1 Mischen mit der 5 µM Proteinlösung in normalem Puffer unterhalb der für Pepsin schädlichen Konzentration (~1M) liegen. Ebenso können die Proteine durch NaCl Zugabe stabilisiert werden (bis zu 4M). Eine Schritt für Schritt Anleitung zum Testen und Optimieren der Proteinstabilität unter Quench-Bedingungen wurde von Keven Juaire erstellt und uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt:
Schritt für Schritt Anleitung zum Testen der Proteinstabilität unter Quenchbedingungen.

Disulfidbrücken:

Wenn Disulfidbrücken für das zu untersuchende Protein bekannt sind, so ist dies bitte unbedingt unter "Comments" im IARS-Auftrag vermerken. Disulfidbrücken sind insofern problematisch, als dass übliche Reagenzien wie DTT oder TCEP unter den sauren Quench-Bedingungen bei 0°C nur sehr langsam reagieren. Deshalb müssen zur Reduktion von Disulfidbrücken unter Quench-Bedingungen dem Quench-Puffer 500 mM TCEP zugesetzt werden. Pepsin hält dies aus, die alternativen Proteasen, die wir derzeit optional anbieten, jedoch nicht, da sie selber über Disulfidbrücken verfügen. Einzige Alternative ist dann eine elektrochemische Reduktion. Derzeit verfügen wir aber (noch) nicht über ein solches Zusatzgerät.