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Monobody

Die Core Facility Monobody hat es sich zum Ziel gesetzt, Nutzer bei der Generierung von Monobody-Proteinen, die mit hoher Affinität und Selektivität an ein Protein ihrer Wahl binden können, zu unterstützen. Monobodies sind synthetische Bindeproteine, die aus der zehnten Fibronektin-Typ-III-Domäne (FN3) des menschlichen Fibronektins als molekulares Gerüst aufgebaut sind, und ergänzen das Repertoire an Mini-Immunglobulin-Gerüsten (Nanobodies, scFvs, Fabs etc.). Monobodies konnten für eine Vielzahl von Proteinklassen entwickelt werden und können ein Zielprotein mit hoher Affinität und Selektivität binden und ggf. inhibieren. Prof. Dr. Shohei Koide (New York University Langone Medical Center), der seit mehr als 10 Jahren mit meinem Labor eng zusammenarbeitet, hat Monobodies erfunden. Zielgerichtete Evolutionstechniken, insbesondere Phagen- und Hefe-Display-Selektion, werden verwendet, um Monobodies aus großen kombinatorischen Proteinbibliotheken, in denen eine Reihe von oberflächenexponierten Aminosäureresten des FN3-Gerüsts mutiert sind, zu generieren (siehe Abbildung unten). Das Molekulargewicht von Monobodies beträgt nur ~10 kDa und damit weniger als ein Zehntel der Größe eines Antikörpers. Das Fehlen von Cysteinresten ermöglicht die stabile Expression und Aktivität von Monobodies auch in der reduzierenden Umgebung des Zytoplasmas von Säugerzellen und erleichtert ihre rekombinante Produktion in Bakterien. Die drei Schritte der Monobodyentwicklung sind:

  • Herstellung des rekombinanten Zielproteins
  • Phagen- und Hefe-Display-Selektion
  • Charakterisierung der verschiedenen Monobodyklone

Service-Leistungen 

Die Facility stellt ihre Expertise auf dem Gebiet des Monobody-Engineering zur Verfügung. Aufgrund der komplexen und arbeitsintensiven Entwicklung von Monobodies ist eine intensive, frühzeitige Projektplanung mit der Core Facility von entscheidender Bedeutung. Basierend auf unserer langjährigen Erfahrung mit Monobodies besprechen wir zunächst, ob die geplanten Anwendungsgebiete für Monobodies erfolgsversprechend sind. Monobodies sind geeignet als genetisch codierte Antagonisten von Protein-Protein Interaktionen, für Pull-down Assays und als Kristallisationschaperone in der Röntgenkristallographie. Für Anwendungen wie z.B. die Detektion von Proteinen und/oder deren post-translationalen Modifikationen in Western-Blots oder immunhistochemischen Anwendungen sind Monobodies weniger geeignet; hier haben klassische Antikörper entscheidende Vorteile.

Wichtigste Voraussetzung für die Monobody-Selektion ist, dass mindestens 1 mg des Zielproteins in hoher Reinheit (>95%), vollständig an einer Stelle biotinyliert, sowie in einem definierten Oligomerisierungszustand von den Nutzern zur Verfügung gestellt werden kann. Zudem gibt es weitere Anforderung an Stabilität und Pufferkompatibilität. Wir unterstützen bei der Ausarbeitung der passenden Expressions- und Reinigungsstrategie für das Zielprotein. Die Expression und Reinigung des Zielproteins kann jedoch nicht von der Core Facility angeboten werden.

Nachdem das Zielprotein in ausreichender Menge und Qualität von den Nutzern zur Verfügung gestellt wurde, findet die Selektion von Monobody-Klonen über Phagen- und Hefe-Display-Selektion durch die Core Facility statt. Die initiale Charakterisierung von Kandidaten-Monobodies wird zusammen mit den Nutzern durchgeführt: Zur Eingrenzung der Anzahl von Kandidaten-Monobodyklonenen führen wir zunächst Messungen der ungefähren Bindungsaffinitäten in einem Hefe-Display-Assay in vitro durch. Nach rekombinanter Expression der interessantesten/besten Monobody-Klone in E. coli (auch hier beraten wir gerne und stellen Protokolle zur Verfügung) bestimmen wir Bindungsaffinitäten mittels Isothermer Titrationskalorimetrie (ITC). Hierfür steht der Core Facility ein Malvern MicroCal PEAQ-ITC System zur Verfügung. Zur Bestimmung der Bindestelle und des Wirkmechanismus der Monobodies ist die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie die bevorzugte Methode. Auch hier stehen wir gerne beratend zur Seite.

 

Referenzen:

Hantschel O., Biancalana, M. and Koide, S. (2020) Monobodies as enabling tools for structural and mechanistic biology. Curr. Opin. Struct. Biol., 60, 167-174

Hantschel O. (2017) Monobodies as possible next-generation protein therapeutics - A perspective. Swiss Medical Weekly, 147, w14545.

Sha, F., Salzman, G., Gupta, A., and Koide, S. (2017). Monobodies and other synthetic binding proteins for expanding protein science. Protein Sci. 26, 910-924.

Koide, A., Wojcik, J., Gilbreth, R. N., Hoey, R. J., and Koide, S. (2012). Teaching an old scaffold new tricks: monobodies constructed using alternative surfaces of the FN3 scaffold. J. Mol. Biol 415, 393-405.

 

Leitung

Prof. Dr. Oliver Hantschel
Institut für Physiologische Chemie
Biochemisch-Pharmakologisches Centrum (BPC)
Karl-von-Frisch-Straße 2

35032 Marburg

 

Kontakt


Tel. 28-65021


Tel. 28-66483